Dasar Teori
Pengertian
Kultur jaringan/Kultur In Vitro/Tissue
Culture adalah suatu teknik untuk mengisolasi, sel, protoplasma,
jaringan, dan organ dan menumbuhkan bagian tersebut pada nutrisi yang
mengandung zat pengatur tumbuh tanaman pada kondisi aseptik,sehingga
bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi
tanaman sempurna kembali.
Dasar Teori Kultur Jaringan
a. Sel dari suatu organisme multiseluler
di mana pun letaknya, sebenarnya sama dengan sel zigot karena berasal
dari satu sel tersebut (Setiap sel berasal dari satu sel).
b. Teori Totipotensi Sel (Total Genetic
Potential), artinya setiap sel memiliki potensi genetik seperti zigot
yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman
lengkap.
Aplikasi Teknik Kultur Jaringan dalam Bidang Agronomi
a. Perbanyakan vegetatif secara cepat (Micropropagation).
b. Membersihkan bahan tanaman/bibit dari virus
c. Membantu program pemuliaan tanaman (Kultur Haploid, Embryo Rescue, Seleksi In Vitro, Variasi Somaklonal, Fusiprotoplas, Transformasi Gen /Rekayasa Genetika Tanaman dll).
d. Produksi metabolit sekunder.
a. Perbanyakan vegetatif secara cepat (Micropropagation).
b. Membersihkan bahan tanaman/bibit dari virus
c. Membantu program pemuliaan tanaman (Kultur Haploid, Embryo Rescue, Seleksi In Vitro, Variasi Somaklonal, Fusiprotoplas, Transformasi Gen /Rekayasa Genetika Tanaman dll).
d. Produksi metabolit sekunder.
Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Regenerasi
1. Bentuk Regenerasi dalam Kultur In
Vitro : pucuk aksilar, pucuk adventif, embrio somatik, pembentukan
protocorm like bodies, dll
2. Eksplan
Eksplan adalah bagian tanaman yang dipergunakan sebagai bahan awal untuk perbanyakan tanaman. Faktor eksplan yang penting adalah genotipe/varietas, umur eksplan, letak pada cabang, dan seks (jantan/betina). Bagian tanaman yang dapat digunakan sebagi eksplan adalah pucuk muda, batang muda, daun muda, kotiledon, hipokotil, endosperm, ovari muda, anther, embrio, dll.
Eksplan adalah bagian tanaman yang dipergunakan sebagai bahan awal untuk perbanyakan tanaman. Faktor eksplan yang penting adalah genotipe/varietas, umur eksplan, letak pada cabang, dan seks (jantan/betina). Bagian tanaman yang dapat digunakan sebagi eksplan adalah pucuk muda, batang muda, daun muda, kotiledon, hipokotil, endosperm, ovari muda, anther, embrio, dll.
3. Media Tumbuh
Di dalam media tumbuh mengandung komposisi garam anorganik, zat pengatur tumbuh, dan bentuk fisik media. Terdapat 13 komposisi media dalam kultur jaringan, antara lain: Murashige dan Skoog (MS), Woody Plant Medium (WPM), Knop, Knudson-C, Anderson dll. Media yang sering digunakan secara luas adalah MS.
Di dalam media tumbuh mengandung komposisi garam anorganik, zat pengatur tumbuh, dan bentuk fisik media. Terdapat 13 komposisi media dalam kultur jaringan, antara lain: Murashige dan Skoog (MS), Woody Plant Medium (WPM), Knop, Knudson-C, Anderson dll. Media yang sering digunakan secara luas adalah MS.
Tabel 1. Komposisi media Murashige dan Skoog (MS)
___________________________________________________
Bahan Kimia Konsentrasi Media (mg/l)
___________________________________________________
1. NH4NO3 1650
2. KNO3 1900
3. CaCL2.2H20 440
4. MgSO4.7H20 370
5. KH2PO4 170
6. FeSO4.7H20 27
7. NaEDTA 37,3
8. MnSO4.4H20 22,3
9. ZnSO4.7H2O 8,6
10. H3BO3 6,2
11. KI 0,83
12. Na2MoO4.2H20 0,25
13. CuSO4.5H20 0,025
14. CoCl2.6H20 0,025
15. Myoinositol 100
16. Niasin 0,5
17. Piridoksin-HCL 0,5
18. Tiamin -HCL 0,1
19. Glisin 2
20. Sukrosa 30.000
____________________________________________________
___________________________________________________
Bahan Kimia Konsentrasi Media (mg/l)
___________________________________________________
1. NH4NO3 1650
2. KNO3 1900
3. CaCL2.2H20 440
4. MgSO4.7H20 370
5. KH2PO4 170
6. FeSO4.7H20 27
7. NaEDTA 37,3
8. MnSO4.4H20 22,3
9. ZnSO4.7H2O 8,6
10. H3BO3 6,2
11. KI 0,83
12. Na2MoO4.2H20 0,25
13. CuSO4.5H20 0,025
14. CoCl2.6H20 0,025
15. Myoinositol 100
16. Niasin 0,5
17. Piridoksin-HCL 0,5
18. Tiamin -HCL 0,1
19. Glisin 2
20. Sukrosa 30.000
____________________________________________________
4. Zat Pengatur Tumbuh Tanaman
Faktor yang perlu diperhatikan dalam penggunaan ZPT adalah konsentrasi, urutan penggunaan dan periode masa induksi dalam kultur tertentu. Jenis yang sering digunakan adalah golongan Auksin seperti Indole Aceti Acid(IAA), Napthalene Acetic Acid (NAA), 2,4-D, CPA dan Indole Acetic Acid (IBA). Golongan Sitokinin seperti Kinetin, Benziladenin (BA), 2I-P, Zeatin, Thidiazuron, dan PBA. Golongan Gibberelin seperti GA3. Golongan zat penghambat tumbuh seperti Ancymidol, Paclobutrazol, TIBA, dan CCC.
Faktor yang perlu diperhatikan dalam penggunaan ZPT adalah konsentrasi, urutan penggunaan dan periode masa induksi dalam kultur tertentu. Jenis yang sering digunakan adalah golongan Auksin seperti Indole Aceti Acid(IAA), Napthalene Acetic Acid (NAA), 2,4-D, CPA dan Indole Acetic Acid (IBA). Golongan Sitokinin seperti Kinetin, Benziladenin (BA), 2I-P, Zeatin, Thidiazuron, dan PBA. Golongan Gibberelin seperti GA3. Golongan zat penghambat tumbuh seperti Ancymidol, Paclobutrazol, TIBA, dan CCC.
5. Lingkungan Tumbuh
Lingkungan tumbuh yang dapat mempengruhi regenerasi tanaman meliputi temperatur, panjang penyinaran, intensitas penyinaran, kualitas sinar, dan ukuran wadah kultur.
Lingkungan tumbuh yang dapat mempengruhi regenerasi tanaman meliputi temperatur, panjang penyinaran, intensitas penyinaran, kualitas sinar, dan ukuran wadah kultur.
Mikropropagasi
Tahapan dalam Mikropropagasi Tanaman
a. Tahap I : Seleksi Tanaman Induk
Seleksi tanaman induk meliputi varietas dan bebas penyakit. Tahap ini dilakukan untuk mengeliminasi kontaminan pada tanaman yang ditujukan untuk memperoleh eksplan steril.
b. Tahap II : Inisiasi
Tahap ini bertujuan mendapatkan kultur aseptik dari tanaman induk yang terseleksi (eksplan yang steril) melalui proses sterilisasi eksplan.
a. Tahap I : Seleksi Tanaman Induk
Seleksi tanaman induk meliputi varietas dan bebas penyakit. Tahap ini dilakukan untuk mengeliminasi kontaminan pada tanaman yang ditujukan untuk memperoleh eksplan steril.
b. Tahap II : Inisiasi
Tahap ini bertujuan mendapatkan kultur aseptik dari tanaman induk yang terseleksi (eksplan yang steril) melalui proses sterilisasi eksplan.
c. Tahap III : Multiplikasi/Produksi Propagula
Tahap ini bertujuan memperoleh organ multiplikasi yang dapat menghasilkan tanaman baru, seperti tunas aksilar atau tunas adventif dll. Pada tahap inilah berapapun jumlah yang ingin kita capai dilakukan melalui beberapa kali sub kultur, seperti bagan di bawah.
Tahap ini bertujuan memperoleh organ multiplikasi yang dapat menghasilkan tanaman baru, seperti tunas aksilar atau tunas adventif dll. Pada tahap inilah berapapun jumlah yang ingin kita capai dilakukan melalui beberapa kali sub kultur, seperti bagan di bawah.
(Pucuk tanaman berukuran 0.3-0.5 cm
setelah disucihamakan dimasukkan ke dalam botol I) —> Menghasilkan 1 x
4 pucuk setelah 8 minggu —> Subkultur I (menjadi 4 kultur) —>
Menghasilkan 4 x 4 pucuk setelah 4-6 minggu —> Subkultur I (menjadi
16 kultur) —> Menghasilkan 16 x 4 pucuk setelah 4 minggu —>
Subkultur III (menjadi 64 kultur) —> Menghasilkan 64 x 4 pucuk
setelah 4 minggu —> Subkultur IV (menjadi 256 kultur) —>
Menghasilkan 256 x 4 pucuk setelah 4 minggu —> Subkultur V (menjadi
1.024 kultur)
d. Tahap IV : Aklimatisasi Plantlet
Tahap ini adalah memindahkan plantlet
dari lingkungan in vitro ke ex vitro. Plantlet biasanya diaklimatisasi
di rumah kaca/plastik. Hal yang perlu diperhatikan saat aklimatisasi
plantlet adalah suhu udara, kelemabab cahaya, media aklimatisasi, dan
cahaya. Fase ini merupakan fase kritis sebelum plantlet dapat ditanama
di lapang.
Laboratorium dan Teknis Pelaksanaan
Fasilitas yang diperlukan untuk Laboratorium Kultur Jaringan adalah :
1. Ruang persiapan
2. Ruang stok
3. Ruang transfer
4. Ruang kultur
5. Areal cuci
6. Areal persiapan aklimatisasi
7. Rumah kaca/rumah plastik
8. Nursery
1. Ruang persiapan
2. Ruang stok
3. Ruang transfer
4. Ruang kultur
5. Areal cuci
6. Areal persiapan aklimatisasi
7. Rumah kaca/rumah plastik
8. Nursery
Teknis Pelaksanaan di Laboratorium
A. Pembuatan Media MS
1. Siapkan 1 labu takar ukuran 1 L
2. Labu takar diisi dengan air destilata sebanyak 200 ml.
3. Stok dipipet sesuai dengan kebutuhan dan dimasukkan ke dalam labu takar.
4. Timbang gula sebanyak 30 g dan agar-agar sebanyak 7 g.
5. Gula dilarutkan dalam 200 ml air destilata dan kemudian dicampur ke dalam labu takar.
6. Volume ditepatkan hingga mencapai 1 liter.
7. PH larutan dengan pH meter atau kertas indikator pH. PH diusahakan 5,8-6.
8. Tuangkan larutan media dalam panci enamel besar, campurkan agar-agar kemudian didihkan sambil diaduk-aduk.
9. Tuangkan media dalam botol kultur setebal 1,5-2 cm.
10. Tutup botol kultur dengan aluminium foil atau tutup plastik khusus yang tahan panas.
11. Botol kultur disterilisasi dalam autoklaf selama 25-30 menit.
B. Sterilisasi eksplan (Salah satu alternatif )
1. Bahan tanaman dimasukkan ke dalam cawan petri steril atau botol steril, tergantung dari ukuran eksplan yang digunakan.
2. Ke dalam botol steril dituangkan larutan Clorox 20% sampai bahan tanaman terndam. Kemudian dibiarkan selama 7 menit.
3. Sementara itu, cawan petri lain dengan air steril disiapkan.
4. Setelah direndam selama 7 menit dalam Clorox 20%, bahan tanaman dibilas dalam air steril di cawan petri kedua selama 5 menit.
5. Bahan tanaman dimasukkan ke dalam larutan Clorox 10% selama 10 menit kemudian dibilas dengan air steril selama 5 menit.
6. Bahan tanaman direndam lagi dalam larutan Betadine 0.25% selama 3-5 menit.
7. Bahan tanaman dibilas dua kali dalam air steril dengan lama perendaman masing-masing 5 menit agar sisa-sisa Betadine pada eksplan dapat larut.
8. Bahan tanaman ditanam dalam media dengan menggunakan alat-alat yang sudah disterilkan.
2. Ke dalam botol steril dituangkan larutan Clorox 20% sampai bahan tanaman terndam. Kemudian dibiarkan selama 7 menit.
3. Sementara itu, cawan petri lain dengan air steril disiapkan.
4. Setelah direndam selama 7 menit dalam Clorox 20%, bahan tanaman dibilas dalam air steril di cawan petri kedua selama 5 menit.
5. Bahan tanaman dimasukkan ke dalam larutan Clorox 10% selama 10 menit kemudian dibilas dengan air steril selama 5 menit.
6. Bahan tanaman direndam lagi dalam larutan Betadine 0.25% selama 3-5 menit.
7. Bahan tanaman dibilas dua kali dalam air steril dengan lama perendaman masing-masing 5 menit agar sisa-sisa Betadine pada eksplan dapat larut.
8. Bahan tanaman ditanam dalam media dengan menggunakan alat-alat yang sudah disterilkan.
C. Penanaman
1. Alat-alat dan lampu alkohol diletakkan agak di sebelah kanan. Lampu alkohol diusahakan tidak terlalu dekat dengan wadah alkohol maupun filter.
2. Sebelum mengambil bahan tanaman, pinset dicelupkan ke dalam alkohol 95% kemudian di bakar sampai alkohol yang melekat di pinset terbakar habis. Setelah itu didinginkan dengan cara meletakkannya di atas cawan petri steril.
3. Media tumbuh disiapkan. Tutupnya (alumunium foil) dibuka dengan hati-hati supaya bagian dalam tutup (alumunium foil) tidak tersentuh. Tutup tersebut diletakkan di bagian kiri tempat kerja, dalam keadaan dalamnya menghadap ke atas ( dalam keadaan terlentang).
4. Botol dipegang dengan tangan kiri dalam keadaan miring. Mulut botol dibakar di atas api alkohol. Ketika membakar mulut botol, sebaikanya botol diputar dengan titik tengah lingkarannya sebagai poros agar seluruh bagian mulut botol terkena api secara merata. Pemutarannya dilakukan dengan hati-hati secara perlahan-lahan.
5. Dengan pinset steril yang sudah dingin, eksplan diambil dan dimasukkan ke dalam media.
6. Sebelum ditutup, mulut botol dan bagian dalam tutupnya (jika menggunakan alumunium foil) sebaiknya dibakar dulu.
7. Tutup botol dikencangkan dengan menggunakan karet gelang.
8. Label ditulis kemudian ditempelkan pada tutup.
Label ini berisi:
- Jenis tanaman (cukup kode).
- Bagian tanaman: daun, anther, pucuk, akar, dan sebagainya.
- Nama media (cukup kode).
- Tanggal penanaman.
9. Larutan HgCl2, bekas dikumpulkan dalam sebuah wadah kemudian dibuang di suatu tempat yang tidak akan mencemarkan sumber air minum, atau diuapkan sehingga diperoleh garam HgCl2 kembali.
1. Alat-alat dan lampu alkohol diletakkan agak di sebelah kanan. Lampu alkohol diusahakan tidak terlalu dekat dengan wadah alkohol maupun filter.
2. Sebelum mengambil bahan tanaman, pinset dicelupkan ke dalam alkohol 95% kemudian di bakar sampai alkohol yang melekat di pinset terbakar habis. Setelah itu didinginkan dengan cara meletakkannya di atas cawan petri steril.
3. Media tumbuh disiapkan. Tutupnya (alumunium foil) dibuka dengan hati-hati supaya bagian dalam tutup (alumunium foil) tidak tersentuh. Tutup tersebut diletakkan di bagian kiri tempat kerja, dalam keadaan dalamnya menghadap ke atas ( dalam keadaan terlentang).
4. Botol dipegang dengan tangan kiri dalam keadaan miring. Mulut botol dibakar di atas api alkohol. Ketika membakar mulut botol, sebaikanya botol diputar dengan titik tengah lingkarannya sebagai poros agar seluruh bagian mulut botol terkena api secara merata. Pemutarannya dilakukan dengan hati-hati secara perlahan-lahan.
5. Dengan pinset steril yang sudah dingin, eksplan diambil dan dimasukkan ke dalam media.
6. Sebelum ditutup, mulut botol dan bagian dalam tutupnya (jika menggunakan alumunium foil) sebaiknya dibakar dulu.
7. Tutup botol dikencangkan dengan menggunakan karet gelang.
8. Label ditulis kemudian ditempelkan pada tutup.
Label ini berisi:
- Jenis tanaman (cukup kode).
- Bagian tanaman: daun, anther, pucuk, akar, dan sebagainya.
- Nama media (cukup kode).
- Tanggal penanaman.
9. Larutan HgCl2, bekas dikumpulkan dalam sebuah wadah kemudian dibuang di suatu tempat yang tidak akan mencemarkan sumber air minum, atau diuapkan sehingga diperoleh garam HgCl2 kembali.
D. Aklimatisasi
1. Perakaran planlet diperiksa: apakah terbentuk dari pucuk atau kalus; apakah sudah terbentuk bulu-bulu akar. Bulu-bulu akar lebih baik perkembangannya di media cair.
2. Planlet yang vitrous tidak akan tahan dikeluarkan dari botol, hanya planlet yang hijau kekar yang dapat bertahan. Oleh karena itu, harus dilakukan seleksi kultur.
3. Kultur yang akan dikeluarkan diberi intensitas cahaya yang tinggi selama 1-2 minggu.
1. Perakaran planlet diperiksa: apakah terbentuk dari pucuk atau kalus; apakah sudah terbentuk bulu-bulu akar. Bulu-bulu akar lebih baik perkembangannya di media cair.
2. Planlet yang vitrous tidak akan tahan dikeluarkan dari botol, hanya planlet yang hijau kekar yang dapat bertahan. Oleh karena itu, harus dilakukan seleksi kultur.
3. Kultur yang akan dikeluarkan diberi intensitas cahaya yang tinggi selama 1-2 minggu.
Pada proses pemindahan, tindakan berikut perlu dilakukan:
1. Semua agar-agar dan bekas media dari planlet dicuci bersih karena media in vitro mengandung gula yang menarik serangga dan serangan penyakit.
2. Pada waktu pencucuian, diusahakan agar akar tidak sampai terputus.
3. Setelah dicuci, agar-agar dan bekas media dari plantlet direndam dalam larutan fungisida 2 g/l selama 30 menit.
4. Media tanam berupa kompos : pasir =1:1 (v/v) sebaiknya media steril/semi steril.
5. Setelah plantlet ditanam dalam pot kecil atau polibag kecil, tanaman disungkup dengan sungkup plastik. Sungkup plastik dapat secara individu maupun untuk beberapa pot.
6. Plantlet diletakkan pada tempat dengan intensitas cahaya 40-59%.
7. Temperatur aklimatisasi antara 25-30 0C. Temperatur lebih dari 30 0C dapat menyebabkan kematianplantlet. Pengaturan temperatur dapat dilakukan dengan penyiraman air secara berkala di atas sungkup.
8. Setelah 10-14 hari, sungkup dibika. Bila kelayuan plantlet masih terjadi , sungkup harus digunakan kembali. Setelah plantlet segar, sungkup dibuka kembali sampai akhirnya plantlet tidak perlu disungkup lagi.
9. Plantlet yang telah menunjukkan pertumbuhan dipindahkan ke nurseri dengan intensitas cahaya yang lebih tinggi. Setelah kuat, tanaman dipindah ke lapangan.
1. Semua agar-agar dan bekas media dari planlet dicuci bersih karena media in vitro mengandung gula yang menarik serangga dan serangan penyakit.
2. Pada waktu pencucuian, diusahakan agar akar tidak sampai terputus.
3. Setelah dicuci, agar-agar dan bekas media dari plantlet direndam dalam larutan fungisida 2 g/l selama 30 menit.
4. Media tanam berupa kompos : pasir =1:1 (v/v) sebaiknya media steril/semi steril.
5. Setelah plantlet ditanam dalam pot kecil atau polibag kecil, tanaman disungkup dengan sungkup plastik. Sungkup plastik dapat secara individu maupun untuk beberapa pot.
6. Plantlet diletakkan pada tempat dengan intensitas cahaya 40-59%.
7. Temperatur aklimatisasi antara 25-30 0C. Temperatur lebih dari 30 0C dapat menyebabkan kematianplantlet. Pengaturan temperatur dapat dilakukan dengan penyiraman air secara berkala di atas sungkup.
8. Setelah 10-14 hari, sungkup dibika. Bila kelayuan plantlet masih terjadi , sungkup harus digunakan kembali. Setelah plantlet segar, sungkup dibuka kembali sampai akhirnya plantlet tidak perlu disungkup lagi.
9. Plantlet yang telah menunjukkan pertumbuhan dipindahkan ke nurseri dengan intensitas cahaya yang lebih tinggi. Setelah kuat, tanaman dipindah ke lapangan.
Semoga Sukses,
